  ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ
ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ
СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
(ИХБФМ СО РАН)
Технологический паспорт коллекции
«Коллекция экстремофильных микроорганизмов и типовых культур»
Новосибирск - 2017
Общая информация:
Название коллекции - «Коллекция экстремофильных микроорганизмов и типовых культур»
Держатель коллекции - Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН)
Цели и задачи – Коллекция экстремофильных микроорганизмов и типовых культур создана, поддерживается и пополняется для выполнения следующих задач:
Изучение биоразнообразия различных экосистем.
Фаготипирование бактериальных культур.
Изучение антибиотикорезистентности, биохимических и генетических характеристик микроорганизмов. Анализ антимикробной активности разрабатываемых препаратов.
Проведение идентификации культур микроорганизмов.
Регистрация и хранение штаммов-продуцентов.
Оказание консультативной и научно-методической помощи научно-исследовательским, образовательным и иным организациям.
Объем коллекции – более 3000 штаммов микроорганизмов, более 200 штаммов бактериофагов. Штаммы микроорганизмов охарактеризованы по морфологическим свойствам колоний и клеток, биохимическим свойствам, антибиотикорезистентности, проведена таксономическая идентификация по гену 16S рРНК, сведения хранятся в базах данных. Штаммы бактериофагов охарактеризованы по литическим свойствам, спектру бактерий-хозяев, для части бактериофагов определены геномные последовательности. Информацию об актуальном составе коллекции можно получить по запросу в виде вывода из электронной базы данных.
АДРЕС:
630090, Россия, г. Новосибирск,
Пр-т Академика Лаврентьева, 8
http://www.niboch.nsc.ru
РУКОВОДИТЕЛЬ:
Тикунова Нина Викторовна, д.б.н.
КОНТАКТНОЕ ЛИЦО:
Тикунова Нина Викторовна,
Морозова Вера Витальевна
тел. (383) 363-51-31
e-mail: tikunova@niboch.nsc.ru,
morozova@niboch.nsc.ru
СОП «Получение чистой культуры микроорганизма из образца»;
СОП «Идентификация таксономической принадлежности бактериального изолята по нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК»;
СОП «Характеризация антибиотикоустойчивости бактериального изолята методом диско-диффузионного анализа»;
СОП «Идентификация таксономической принадлежности изолята грибов по нуклеотидным последовательностям межгенных спейсеров ITS и NS»;
СОП «Идентификация бактериального штамма по биохимическим свойствам с использованием анализатора GenIII OmniLog»
СОП «Проверка жизнеспособности депонированной культуры микроорганизма из Коллекции ЭМТК».
Полная версия СОПов : http://www.niboch.nsc.ru/doku.php/emtc_collection
Молекулярно-биологическая лаборатория
Боксовые помещения, боксы микробиологической безопасности II класса.
Комната для хранения.
СОП № ЛММБ 2-3-2017-09
Получение чистой культуры микроорганизма из образца
Составили: к.б.н., с.н.с. В.В. Морозова, вед. инженер А.В.Бардашева
Местонахождение: ИХБФМ СО РАН
Пересмотр через 1 год
Введение, цель
Настоящая методика устанавливает порядок получения чистой культуры микроорганизма для последующей идентификации и депонирования в Коллекцию ЭМТК.
Назначение
Получение чистых культур микроорганизмов из различных природных образцов, включая образцы почвы, образцы от животных, растений, людей и пр., является основным этапом пополнения Коллекции ЭМТК.
Термины и определения
СОП – стандартная операционная процедура;
Асептика – комплекс мер направленных на предупреждение попадания в рабочую зону сторонних микроорганизмов;
Селективные среды – питательные среды для выделения определенных микроорганизмов за счет создания благоприятных для них условий роста и неблагоприятных условий для сопутствующих микроорганизмов других видов;
РПА – рыбо-пептонный агар;
СМА – сердечно-мозговой агар;
СМА – сердечно-мозговой агар.
Пересмотр: Данная СОП вводится впервые.
-
Материалы и оборудование
. Материалы и реактивы
Наименование основных реактивов и материалов
|
НТД, производитель, страна
|
РПА
|
ТУ 9385-012-14237183-07
|
СМА
|
BioMerieux, Франция
|
Бактоагар
|
BD, США
|
Дрожжевой экстракт
|
BD, США
|
Триптон
|
BD, США
|
Глицерин
|
ГОСТ 6259-75
|
Среда Левина
|
Oxoid, Великобритания
|
Коринебакагар
|
ТУ 9398-019-78095326-2006
|
Среда Китта-Тароцци
|
Биотехновация, Россия
|
MRS агар
|
Himedia, Индия
|
Сальмонелла, шигелла агар
|
Oxoid, Великобритания
|
Агар Мак-Конки без кристаллического фиолетового
|
BioMerieux, Франция
|
Солевой агар с маннитом
|
BioMerieux, Франция
|
Агар CLED
|
BioMerieux, Франция
|
Сабуро агар
|
BioMerieux, Франция
|
Дезоксихолатный цитратный агар
|
Oxoid, Великобритания
|
Агар Эндо
|
ТУ 9398-027-78095326
|
Пробирки типа Eppendorf, 1.5 мл
|
Thermo, Россия
|
Наконечники для автоматических дозаторов до 200 мкл
|
«Eppendorf», США
|
Спирт этиловый, ректифицированный
|
ЛРС 000279/10
|
Перекись водорода, медицинская
|
ГОСТ 177-88
|
Вода дистиллированная рН от 5,0 до 7,0.
|
ГОСТ 6709-72
|
Натрий хлористый, хч
|
ГОСТ 4233-77
|
Чашки Петри, пластиковые диаметр 90 мм
|
Greiner Bio-One, Австрия
|
Чашки Петри, пластиковые диаметр 90 мм, трехсекционные, четырехсекционные
|
Greiner Bio-One, Австрия
|
Предметные стекла
|
Isolab, Германия
|
Пакеты для стерилизации
|
Citotest, Китай
|
Покровные стекла
|
Стеклоприбор, Россия
|
Набор красителей по Грамму
|
БиоВитрум, Россия
|
Бактериологическая петля пластиковая одноразовая
|
Citotest, Китай
|
Газогенерирующие пакеты, 3,5 л
|
Oxoid, Великобритания
|
Флаконы градуированные c завинчивающейся крышкой, 500 мл
|
Isolab, Германия
|
Спиртовка лабораторная
|
ГОСТ 23932-90Е
|
Пробирки с закручивающимися крынками, 2,0 мл DNase-free, RNase-free
|
SSIBIO, США
|
Колбы мерные вместимостью 250 мл
|
ГОСТ 1770-74
|
Комплект цилиндров вместимостью 50 мл, 500 мл и 1 л
|
ГОСТ 1770-74
|
Петля микробиологическая с ушком, d 1,5 мм, нержавеющая сталь
|
Bochem, Германия
|
Оборудование
|
НТД, производитель, страна
|
Баня водяная лабораторная
|
BioSan, Латвия
|
Бокс биологической (микробиологической) безопасности II класс
|
Lamsystems, Россия
|
Микроскоп Imager A2
|
Carl Zeiss, Швейцария
|
Холодильник
|
Indesit, Италия
|
Автоматическая пипетка вместимостью 20÷200 мкл
|
«Ленпипет», Россия
|
Весы электронные аналитические
|
Ohaus, США
|
Термостат суховоздушный лабораторный ТСвЛ-80
|
ТУ-9452-006-07505566-2006
|
Анаэростат, 2,5 л
|
Oxoid, Великобритания
|
Автоклав ВК-75
|
ТЗМОИ, Россия
|
Вортекс
|
BioSan, Латвия
|
Одежда
|
НТД, производитель, страна
|
Колпак медицинский
|
ГОСТ 2313478
|
Перчатки хирургические резиновые
|
ГОСТ 3-88
|
Маска медицинская
|
ГОСТ EN 13795-1-2011
|
Халат медицинский
|
ГОСТ 24760-81
|
Помещения
Проведение работ осуществляется в боксовых помещениях, в которых находятся боксы биологической (микробиологической) безопасности II класса.
-
Процедура
Подготовительный этап
7.1.1. Подготовка персонала к проведению работ
– надеть медицинский халат и перчатки
7.1.2. Приготовление дезинфицирующего раствора
– приготовить 3% раствор перекиси водорода, в стеклянный цилиндр налить (100±1) мл 30% перекиси водорода и довести объем до 1000 мл водопроводной водой, данный раствор может быть использован в течение 48 ч;
7.1.3. Подготовка боксового помещения к работе
– обработать 3% раствором перекиси водорода поверхности помещения и оборудования до начала работ;
– обработать ламинарный бокс и помещение ультрафиолетовыми лучами до начала работ в течение 15 мин.
7.1.4. Приготовление 70% раствора этилового спирта
– налить в стеклянный цилиндр (70±1) мл 96% этилового спирта и довести объем до 100 мл дистиллированной водой;
7.1.5. Приготовление LB-среды для хранения культур
– приготовить 50% (об./об.) раствор глицерина в дистиллированной воде;
– автоклавировать при 121°С в течение 15 мин;
– взвесить (3,0±0,1) г триптона, внести в мерный циллиндр;
– взвесить(1,5±0,1) г дрожжевого экстракта, внести в мерный цилиндр с триптоном. Добавить дистиллированной воды до 300 мл;
– разлить по флаконам градуированным;
– автоклавировать при 121°С в течение 15 мин;
– смешать в асептических условиях равные объемы среды LB и 50% раствора глицерина;
– разлить в стерильные пробирки объемом 2 мл с завинчивающейся крышкой по 200 мкл. Инкубировать при (36±1)°С в течение 18 – 24 ч для выявления случайной контаминации.
7.1.6. Приготовление физиологического раствора
– взвесить (0,90,1) г хлорида натрия, внести в мерную колбу вместимостью 100 мл и добавить дистиллированной воды до метки;
– перемешать до полного растворения соли;
– разлить по флаконам градуированным;
– автоклавировать при 121°С в течение 15 мин.
7.1.7. Подготовка чашек Петри с питательной средой
– приготовить питательную среду согласно инструкции производителя;
– разлить питательную среду после автоклавирования в стерильные чашки Петри толщиной (4,00,5) мм и оставить для застывания при комнатной температуре.
7.2. Основной этап
7.2.1. Первичная микроскопия
7.2.1.1 Микроскопия нативных препаратов
– обжечь предметное стекло в пламени спиртовки;
– нанести небольшое количество стерильного физиологического раствора;
– внести прокаленной бактериологической петлей небольшое количество образца. Петлю обеззараживают прожиганием. Сверху препарат накрыть покровным стеклом;
– микроскопировать, производя первичную идентификацию по морфологическим свойствам;
– погрузить препарат в 3% раствор перекиси водорода после окончания микроскопирования. Экспозиция не менее 6 ч.
7.2.1.2. Микроскопия мазков окрашенных по Грамму
– обжечь предметное стекло в пламени спиртовки;
– нанести небольшое количество стерильного физиологического раствора;
– внести прокаленной бактериологической петлей небольшое количество образца. Петлю обеззараживают прожиганием;
– оставить предметное стекло на воздухе до полного высушивания;
– провести фиксацию микропрепарата: предметное стекло трижды накладывают на пламя спиртовки в верхней части на 2 секунды с интервалом 4 секунды (суммарно в пламени 6 секунд). Это позволяет убить микроорганизмы, прикрепить их к стеклу и повысить восприимчивость к красителям;
– поместить на мазок полоску фильтровальной бумаги и нанести на фиксированный мазок несколько капель карболового раствора генцианвиолета (реагент 1) и выдержать 2-3 минуты. Слить краску, удалить фильтровальную бумагу и сполоснуть в проточной воде (до 30 сек);
– залить мазок на 1-2 мин раствором Люголя (реагент 2) до почернения препарата;
– слить раствор, мазок промыть дистилированной водой;
– дифференцировать 96° спиртом, наливая и сливая его, пока отходит синяя краска и не обесцветится мазок (приблизительно 20-60 секунд). Во время дифференцировки препарат все время покачивают;
– промыть тщательно стекло в дистиллированной воде 1-2 мин;
– окрасить препарат дополнительно раствором сафранина (реагент 3) (несколько капель) в течение 2-3 минут для выявления грамотрицательной группы бактерий;
– промыть в проточной воде и высушить фильтровальной бумагой. Грамположительные бактерии имеют сине-фиолетовый цвет (темно-синий), а грамотрицательные - розово-красный, красный или коричневый;
– микроскопировать, производя первичную идентификацию по морфологическим свойствам;
– погрузить препарат в 3% раствор перекиси водорода после окончания микроскопирования. Экспозиция не менее 6 ч.
7.2.2. Первичный посев на селективные среды
– обработать рабочую поверхность ламинарного бокса и руки 70% раствором спирта;
– при неизвестных условиях роста микроорганизмов посев проводить параллельно на трех- или четырехсекционные чашки Петри с различными питательными средами и инкубировать их после посева при различных температурных условиях и различном газовом составе окружающей атмосферы;
– прокалить бактериологическую петлю в пламени спиртовки, остудить, забрать материал и густо засеять верхнее поле чашки Петри с соответствующей питательной средой, для выделения чистой культуры (Таблица 1);
|
