На правах рукописи
Слюзова Ольга Владимировна
экотоксикологическое Влияние кадмия
на антиоксидантные процессы млекопитающих
в модельной системе белых крыс
и их потомства
03.00.16 – экология
03.00.04 – биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Саратов – 2008
Работа выполнена на кафедре биохимии и биофизики ГОУ ВПО
«Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского»
Научный руководитель: кандидат биологических наук,
вед. научный сотрудник
Киреев Роман Александрович
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор,
Заслуженный деятель науки РФ
Игнатов Владимир Владимирович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Анищенко Татьяна Григорьевна
доктор биологических наук,
ст. научный сотрудник
Соколов Олег Игоревич
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Саратовский государственный технический университет»
Защита состоится «3» июля 2008 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.243.13 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83. E-mail: biosovet@sgu.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского»
Автореферат разослан «30» мая 2008 г.
Ученый секретарь
д иссертационного совета С.А. Невский
Общая характеристика работы
Актуальность исследования. Изменение состояния окружающей среды в промышленно развитых странах побуждает проводить интенсивное изучение воздействия экологических факторов на биологические объекты. Во многих странах приоритетной группой экотоксикантов считаются тяжелые металлы и, в частности, кадмий. Загрязненность окружающей среды тяжелыми металлами отмечается в ряде регионов России, в том числе в Поволжье.
По информации комитета охраны окружающей среды и природопользования Саратовской области, в Саратове на протяжении последних лет сохраняется превышение предельно допустимых концентраций по кадмию в грунтовых водах, почве и снеговом покрове, обусловленное наличием в селитебной зоне города стационарных промышленных источников загрязнения (О состоянии…, 2002, 2006).
Особенность кадмия состоит в том, что он очень медленно выводится из организма, и длительное поступление даже небольших доз этого элемента в условиях экологического неблагополучия может привести к развитию нарушений деятельности сердечно-сосудистой, нервной, иммунной систем, функций почек, печени, развитию онкологических заболеваний, появлению врожденных пороков развития у потомства (Shukla et al., 1988; Jamall et al., 1989; Wang et al., 1994; El-Safty et al., 1996; Koyu et al., 2006). Считается, что главным механизмом токсического действия кадмия является индукция окислительного стресса. В связи с этим весьма перспективной представляется оценка про-антиоксидантного баланса организма в условиях экологического неблагополучия с целью ранней диагностики и патогенетически обоснованного лечения заболеваний. Одной из основных антиоксидантных систем клетки является глутатионовая система, представляющая собой трипептид глутатион и группу ферментов, катализирующих реакции с его участием. В многочисленных работах зарубежных ученых показано влияние кадмия на глутатионовую систему детоксикации (Ulusu et al., 2003; El-Demerdash et al., 2004; Casalino et al., 2004, 2006; Han et al., 2006; Esrefoglu et al., 2007; Sinha et al., 2007). Тем не менее, в литературе отсутствуют сведения об активности этой системы и интенсивности процессов перекисного окисления у потомства при воздействии соединений кадмия в период беременности и лактации.
Актуальность настоящего исследования связана с необходимостью прогнозирования последствий влияния ионов кадмия на организмы матери и ребенка с целью разработки профилактических мероприятий по снижению детской заболеваемости и смертности, особенно в послеродовой период.
Цель исследования: выявление экотоксикологического воздействия кадмия на антиоксидантные процессы у млекопитающих в модельной системе белых крыс и их потомства.
Задачи исследования:
- изучить активность ферментов глутатионовой системы (глутатион-S-трансферазы и глутатионредуктазы) и содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах, а также процессы свободнорадикального окисления в тканях самок белых крыс при воздействии нитрата кадмия и рассмотреть их изменения в процессе адаптации;
- оценить ответную реакцию глутатионовой системы эритроцитов у двух- и четырехмесячного потомства самок белых крыс, подвергавшихся влиянию ионов Cd2+ во время беременности;
- исследовать активность глутатионовой системы в эритроцитах, печени, почках, сердце и мозге двух- и четырехмесячного потомства белых крыс при неонатальном воздействии ионов Cd2+;
- рассмотреть динамику процессов свободнорадикального окисления в плазме крови и органах двух- и четырехмесячного потомства после токсического действия ионов Cd2+ в неонатальный период;
- оценить половые различия и органоспецифичность кадмиевого воздействия, определить особенность действия различных доз ионов Cd2+ на активность глутатионовой системы и уровень свободнорадикального окисления в организме экспериментальных животных.
Научная новизна. Показано, что подострое воздействие нитрата кадмия сопровождается краткосрочным увеличением активности ферментов глутатионовой системы и содержания восстановленного глутатиона в эритроцитах. Впервые установлено, что воздействие кадмия на самок крыс во время беременности вызывает изменения активности глутатионовой системы эритроцитов, связанные с полом и возрастом потомства. В группе самок активность повышается к двухмесячному возрасту с последующей нормализацией к четырем месяцам развития. У самцов наблюдается сниженная активность глутатионовой системы к двум месяцам, сменяющаяся повышением к четырехмесячному возрасту. Впервые выявлено дозозависимое снижение интенсивности работы глутатионовой системы, содержания антиоксидантов и усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ) в эритроцитах, печени, почках, сердце и мозге у двухмесячного потомства, получавшего Cd2+ с материнским молоком. Установлено, что к четырехмесячному возрасту активность глутатионовой системы возрастает в печени и эритроцитах, в почках и сердце возвращается к контрольному уровню, а в мозге остается сниженной. Отмечено, что процессы свободнорадикального окисления усиливаются при неонатальном воздействии кадмия у двухмесячных животных, к четырехмесячному возрасту наблюдается тенденция к стабилизации во всех изученных органах. В плазме крови к четырехмесячному возрасту пероксидация прогрессирует. Введение токсиканта в пренатальный или неонатальный периоды приводит к более интенсивному изменению изучаемых параметров у потомства в группе самцов по сравнению с самками.
Научно-практическая значимость. Показано, что наиболее подвержены токсическому влиянию низких доз кадмия процессы ПОЛ и активность глутатионовой системы мозга. Установлено, что пренатальный и неонатальный периоды являются столь чувствительными для токсического воздействия, что даже незначительные количества кадмия, проникающие к плоду или в организм потомства с материнским молоком, способны вызывать изменения в функционировании глутатионовой системы и нарушения процессов свободнорадикального окисления, которые регистрируются у подопытных животных даже по достижении половой зрелости. В связи с этим представляется целесообразным рекомендовать пересмотр в сторону уменьшения предельно допустимых концентраций кадмия для снижения риска развития патологических состояний. Изменение активности глутатионовой системы может быть признано маркером не только прямого, но и опосредованного через материнский организм экотоксикологического воздействия кадмия на потомство. Выявленные гендерные различия в реакции на кадмиевую интоксикацию могут в дальнейшем послужить основой для подбора антидотов или ведения антитоксической терапии не только в зависимости от возраста и дозы токсиканта, но и с учетом пола.
Основные результаты работы используются в научно-педагогической деятельности кафедры биохимии и биофизики Саратовского государственного университета. Материалы диссертации включены в руководство к практическим занятиям по экологической токсикологии для студентов биологического факультета СГУ, применяются в работе Центральной научно-исследовательской лаборатории Саратовского государственного медицинского университета.
Апробация работы. Основные результаты диссертационного исследования были доложены и обсуждены на: 6-й международной конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2003); 2-м Съезде токсикологов Украины (Киев, 2004); 5-й открытой окружной конференции молодых ученых «Наука и инновации XXI века» (Сургут, 2004); международной научной конференции «Свободные радикалы и антиоксиданты» (Лодзь, Польша, 2004); 9-й международной научной конференции «Науки о жизни 04» (Нова Горица, Словения, 2004); 6-м конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2005); 43-м конгрессе Европейского общества токсикологов и 6-м конгрессе токсикологии в развивающихся странах «Евротокс 2006/6 КТРС» (Кавтат/Дубровник, Хорватия, 2006); 6-й международной научной конференции «Состояние биосферы и здоровье людей» (Пенза, 2006); международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006); научной конференции «Исследования молодых ученых и студентов в биологии» (Саратов, 2007); международной научной конференции «Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов. Экология и здоровье человека» (Астрахань, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, две из которых в изданиях перечня ВАК РФ.
Декларация личного участия автора. Лабораторные эксперименты проведены автором лично по плану, согласованному с научным руководителем. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно. В совместных публикациях вклад автора составил 50-80%.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, состоит из введения, трёх глав, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 430 источников, в том числе - 341 зарубежный, иллюстрирована 28 рисунками и 11 таблицами.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. В условиях экологического неблагополучия низкие дозы кадмия, попадающие в организм потомства, способны изменять активность глутатионовой системы и вызывать состояние окислительного стресса.
2. В ответ на кадмиевую интоксикацию активность глутатионовой системы изменяется по-разному у самок и самцов в эритроцитах при пренатальном, и в сердце и почках при неонатальном воздействии.
3. Влиянию кадмия в неонатальный период наиболее подвержены биохимические процессы в мозге потомства.
Содержание работы
Во введении обосновывается актуальность темы диссертационного исследования, определяются основные задачи и формулируется цель работы, отмечается научная новизна и практическая значимость полученных результатов, приводятся сведения об апробации работы, определяются основные положения диссертации, выносимые на защиту.
Глава 1. Кадмий как экологический фактор,
воздействующий на живые организмы (обзор литературы)
В данной главе приведена информация о распространении кадмия в среде обитания человека. Кадмий, в связи с его широким применением в промышленном производстве на предприятиях города, можно считать одним из основных экополлютантов г. Саратова. На основании данных отечественной и зарубежной литературы описаны токсикологические свойства кадмия, главные известные механизмы воздействия на органы и системы живых организмов, последствия влияния кадмия на организм матери, новорожденного и эмбрион. Представлена информация об антиоксидантной глутатионовой системе и влиянии кадмия на её активность. На основании приведенного обзора литературы сформулирована цель и определен круг задач, решаемых в данной работе.
Глава 2. Материалы и методы исследования
Перечень условных сокращений: GR – глутатионредуктаза; GSH – глутатион восстановленный; GSSG – глутатион окисленный; GST – глутатион-S-трансфераза; γ-GT – γ-глутамилтрансфераза; Hb – гемоглобин; Imax – максимальная интенсивность хемилюминесценции; Sобщ – общая светосумма импульсов хемилюминесценции; ГКНА – L-глутамил-3-карбокси-4-нитроанилид; ХДНБ – 1-хлор-2,4-динитро-бензол.
Исследования проводили в 2002-2007 гг. на беспородных крысах обоего пола в количестве 213 особей. Эксперименты на грызунах осуществляли в соответствии с требованиями Женевской конвенции (International Guiding…, 1985). В качестве вещества, моделирующего условия экологического загрязнения, использовали государственный стандартный образец ионов кадмия (ГСО 7874-2000), представляющий собой Cd(NO3)2. Токсикант вводили перорально, с помощью зонда, натощак.
Выявление краткосрочных механизмов адаптации в ответ на подострую кадмиевую интоксикацию проводили на самках, которым в течение 10 дней вводили физиологический раствор (контрольная группа), или нитрат кадмия в дозе 2 мг/кг в пересчете на Cd2+. Исследование осуществляли через 1, 4 и 8 дней после последнего введения токсиканта (1-я, 2-я и 3-я опытные группы соответственно).
Изучение пренатального влияния ионов кадмия проводили на потомстве самок крыс, которым с 6-го по 15-й день беременности вводили нитрат кадмия в дозе 2 мг/кг в пересчете на Cd2+ (опытная группа) и физиологический раствор (контрольная группа). Исследование потомства, с разделением на группы самок и самцов, осуществляли на 60-й и 120-й дни жизни.
Для изучения воздействия ионов кадмия в период новорожденности использовали самок, которым с 1-го по 10-й дни лактации вводили Cd(NO3)2 в дозе 0,5 и 2 мг/кг в пересчете на Cd2+ (опытные группы) и физиологический раствор (контрольная группа). Потомство (самки и самцы) подвергали исследованию на 60-й и 120-й дни жизни.
Для анализа использовали гепаринизированную плазму, эритроцитарную массу и супернатант гомогенатов органов (печени, почек, сердца и мозга), подготовленные по общепринятым методам.
Определение состояния глутатионовой системы по активности GST, GR и содержанию GSH производили в эритроцитах и супернатанте гомогенатов органов (Медицинские лабораторные технологии, 2002). В плазме крови и супернатанте гомогенатов органов определяли также активность γ-GT с помощью коммерческого набора «Гамма-Глутамилтрансфераза Liquid», изготовитель «Lachema», и содержание монооксида углерода (Wolff, 1976). Кроме того, в супернатанте гомогенатов органов и плазме крови исследовали параметры индуцированной хемилюминесценции, свидетельствующие об уровне про- и антиоксидантов: максимальную интенсивность хемилюминесценции и общую светосумму импульсов хемилюминесценции (Густов и др., 1999). Содержание гемоглобина определяли гемцианидным методом с помощью коммерческого набора «Гемциан-Диахим», изготовитель «Абрис+», количество белка в образцах определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976). В работе использовали центрифугу Т-24, спектрофотометр СФ-46, анализатор Флюорат®-02-Панорама, биохемилюминометр БХЛ-06.
Полученные данные обрабатывали общепринятыми статистическими методами (Реброва, 2002), с использованием пакета «STATISTICA 6.0» (STAT – SOFT, 2001).
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение
3.1 Изучение краткосрочных механизмов адаптации
к воздействию Cd(NO3)2 у самок крыс
Установлено, что воздействие на экспериментальных животных ионами кадмия в дозе 2 мг/кг в течение 10 дней приводит к достоверному снижению GST, GR и GSH эритроцитов у животных 1-й группы относительно контрольного уровня в 2,2 раза, 2 и 1,4 раза соответственно (рис. 1). После 4 дней адаптации у животных отмечается увеличение активности GST в 1,3 раза, GR – в 2,2 раза и содержания GSH – в 1,5 раза по сравнению со значениями 1-й группы. По прошествии 8 дней после последнего введения токсиканта обнаруживается уменьшение изучаемых показателей относительно уровня 2-й группы: GST – в 1,5 раза, GR – в 1,8 раза, GSH – в 1,3 раза, при этом все они оказываются ниже контрольных значений.
|
|
а
|
б
|
|
